בתקופת המנדט הבריטי בארץ-ישראל (1947-1917) שימשה המצודה ככלא מרכזי ושמור היטב בחומות ובחפיר. נכלאו כאן מאות עצורים לפני משפט, מעפילים לא ליגאליים וכן אסירים פליליים ואחרים, ערבים ויהודים.

רבים מבין הכלואים היו יהודים שנאבקו במנדט הבריטי ובהם חברי ארגון "השומר" חיים שטורמן וצבי ניסנוב (שנת 1912) וזאב ז'בוטינסקי וחבריו ממגיני ירושלים (1920). ביוני 1938 הועלה לגרדום שלמה בן יוסף חבר לח"י. בשנת 1939 נכלאו כאן משה דיין וחבריו לקורס הקצינים של ההגנה ועוד מחברי המחתרות לח"י, ההגנה והאצ"ל. באפריל 1947 הועלו לגרדום ארבעת אנשי האצ"ל: דוב גרונר, יחיאל דרזנר, אליעזר קשאני ומרדכי אלקחי. באותו חודש גם פוצצו עצמם בכלא ירושלים שני חברי לח"י מאיר פיינשטיין ומשה ברזני, המונצחים כאן.
במאי 1947 נפרץ הכלא בידי לוחמי האצ"ל ורבים מן הכלואים בו, יהודים וערבים, נמלטו. חלקם נתפס לאחר זמן ומיעוטם הוצא להורג. ביולי 1947 הועלו לגרדום אנשי האצ"ל יעקב וייס, מאיר נקר ואבשלום חביב מפורצי הכלא.
בשנים 2007 – 2008 עבר המתחם שיפוצים נרחבים, כולל הכשרת חדרי האסירים ובתי המלאכה לביקורי קהל.

במקומות אחדים על קירות בית הכלא חרטו האסירים למעלה ממאה פריטים. ארבעה מהם נראים בתמונות הבאות:

תמונה מס' 1. 38 משתתפי קורס האצ"ל שנערך במשמר הירדן נתפסו על ידי הבריטים והובאו לכאן בנובמבר 1939. שם קבוצה "אסירי משמר" נראה כאן על רקע "המנורה" – סמלה של תנועת בית"ר. 

תמונה מס' 3. עמוד התליה והגופה התלויה במרומיו מסמל את חדר הגרדום של הכלא, שהיה אימת כל הכלואים בו.

תמונה מס' 4. שמותיהם של 12 נערים שהשתתפו בקורס איתות  של ההגנה באזור עפולה ונתפסו על ידי הבריטים. 

התמונות באדיבות משרד הביטחון – מוזיאון אסירי המחתרות בעכו

  בהמשך מפה מוסברת של מתחם המוזיאון (לחץ)